強直性肌營養(yǎng)不良 1 型（DM1）是一種復(fù)雜的遺傳性疾病，主要由肌營養(yǎng)不良肌強直蛋白激酶（DMPK) 基因 3’非編碼區(qū)的 CTG 重復(fù)擴增引起的。DM1 疾病表型，嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡變異性極高，主要癥狀包括肌強直、肌肉萎縮、肌無力、心臟傳導(dǎo)缺陷、白內(nèi)障和胰島素抵抗等。2020 年 2 月 5 日，伯豪客戶中科院上海生化細(xì)胞所的李勁松及胡蘋研究團隊在 Cell Research 上聯(lián)合發(fā)表了題為“Dosage effect of multiple genes accounts for multisystem disorder of myotonic dystrophy type 1”的研究論文。研究人員利用半克隆技術(shù)將帶有突變 Dmpk、Six5 和 Mbnl1 的單倍體胚胎干細(xì)胞注射到小鼠卵母細(xì)胞中，建立攜帶多基因雜合突變的小鼠模型來模擬多基因劑量的減少，為開展 DM1 致病機制和藥物篩選研究提供了新模型。

研究人員首先通過半克隆技術(shù)結(jié)合 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建了 Dmpk、Six5 和 Mbnl1 雜合突變的孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞（AG-haESCs），并通過 ICAHCI 技術(shù)注入卵子進(jìn)而一步獲得 Dmpk、Six5 和 Mbnl1 三基因雜合突變的半克隆小鼠模型。全基因組測序分析結(jié)果顯示沒有脫靶效應(yīng)，表型分析顯示該半克隆小鼠產(chǎn)生了肌無力、肌萎縮、嚴(yán)重運動障礙、呼吸和消化功能紊亂等典型的 DM1 表型，但沒有先天性 DM1（CDM）的表型，提示其他基因的劑量變化可能與此相關(guān)。

Dmwd 參與 DM1           

根據(jù)已有研究結(jié)果，Dmpk 中 CTG 重復(fù)序列的擴增會通過改變局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生等位基因特異性作用，下調(diào) Dmpk 兩個相鄰基因 Six5（Dmpk 的下游）和 Dmwd（Dmpk 的上游）的表達(dá)。研究人員通過 CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建 Dmwd 突變細(xì)胞并注入小鼠體內(nèi)，表型分析顯示 Dmwd 突變小鼠肌纖維 CSA 顯著降低，但其他 DM1 表型未被觀察到，提示 Dmwd 突變會影響 DM1 表型，但不足以解釋 DM1 的所有復(fù)雜多系統(tǒng)癥狀。

四基因雜合突變模型分析            

研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了 Dmpk、Six5、Mbnl1 和 Dmwd 四基因雜合突變的小鼠模型，以了解更多的 DM1 癥狀。脫靶分析顯示在被測細(xì)胞中沒有新的突變位點，表型分析顯示四基因雜合突變小鼠有先天性 DM1 表型，22% 小鼠在出生后數(shù)小時內(nèi)死亡，其主要原因是膈肌發(fā)育異常導(dǎo)致的肺擴張失敗。存活小鼠有嚴(yán)重的肌強直、肌無力、肌肉萎縮和運動缺陷等一系列典型的 DM1 表型。上述結(jié)果表明 Dmwd 參與其中的多基因劑量減少是 DM1 表型產(chǎn)生的主要原因。

基于已有研究結(jié)果顯示 DM1 患者的肌肉干細(xì)胞存在缺陷，研究人員對三基因雜合突變和四基因雜合突變小鼠的肌肉干細(xì)胞進(jìn)行了相應(yīng)的分析，結(jié)果顯示，兩種小鼠的肌肉干細(xì)胞數(shù)量和增殖能力與正常小鼠相比沒有明顯差異，但是肌肉干細(xì)胞的干性顯著降低，從而導(dǎo)致肌肉分化的缺陷。全基因組轉(zhuǎn)錄分析及可變剪切分析（伯豪生物提供）提示干細(xì)胞階段分化基因的過早表達(dá)導(dǎo)致干細(xì)胞特性部分喪失，可能是突變體 MuSCs 體內(nèi)外分化潛能降低的原因。研究人員進(jìn)一步建立了促進(jìn)肌肉干細(xì)胞分化的小分子篩選系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn) T5381948 在細(xì)胞水平上能緩解肌肉分化異常表型，為進(jìn)一步開展大規(guī)模 DM1 藥物篩選研究奠定了基礎(chǔ)。

該研究開發(fā)了一種新策略，通過半克隆技術(shù)快速構(gòu)建多基因雜合突變小鼠模型來模擬 DM1 的多數(shù)表型，一定程度上證明了 Dmpk 中 CTG 重復(fù)序列的異常擴增會導(dǎo)致多個基因表達(dá)水平下調(diào)從而誘發(fā) DM1 的復(fù)雜病理表型，這些模型的建立為深入研究 DM1 的發(fā)病機理和進(jìn)行藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。